안녕하세요~
오늘은 UV-Vis Spectroscopy 마지막 내용으로 UV-Vis Spectrometer (분광광도계)의 작동원리에 대해서 알아보겠습니다.
대학원/연구실에서는 실험, 연구를 진행하면서 많은 분석장비들을 사용하는데요,
우리가 장비를 사용해서 분석을 진행했을 때, 결과로 받아보는 숫자들이 어떤 과정을 통해서 계산되었는지,
그리고 장비가 어떻게 작동하는지 아는 것이 중요합니다.
그럼 우리가 지금까지 알아본 UV-Vis Spectroscopy에 사용되는 분광광도계 장비가 어떻게 작동하는지 알아봅시다.
기본적으로 UV-vis spectrometer/분광광도계 장비는 아래와 같은 구성 요소들로 이루어져 있습니다.
UV-vis spectrometer 구성 요소
- 광원 (Light source)
- 단색화장치/ 파장선택기 (Monochrometer)
- 분석시료 (Sample)
- 검출기/측광기 (Detector/Photocell)
자세한 작동원리를 살펴보기 전에, 간략한 측정 원리에 대해서 먼저 이야기해 보자면
- 광원에서는 다양한 파장을 갖는 빛을 방출하고
- 단색화장치에서 특정 파장의 빛을 분리하고 난 뒤에
- 분리된 단일파장의 빛이 분석시료를 통과하고 나면
- 시료를 통과한 빛의 세기를 측정하여, 시료 투과 전/후를 비교하여 얼마만큼의 빛이 시료에 의해 흡수되었는지를 결과값으로 얻게 됩니다.
그리고 이러한 과정을 원하는 범위의 파장의 빛에 대해서 모두 진행하면, 아래 그림의 오른쪽과 같은 스펙트럼을 얻을 수 있습니다.
그럼 이제 각각의 구성 요소들에 대해서 자세히 살펴보겠습니다.
1. 광원 (Light source)
먼저 분석에 필요한 빛을 제공하는 광원에 대해서 알아보겠습니다.
사실 가장 이상적인 광원은, 모든 파장에 대해서 동일한 빛의 세기를 갖는...그런 현실에 존재하지 않는 광원이죠 ㅎ
하지만 그런 광원은 만들기 매우 어렵고, 설사 만들 수 있더라 하더라도 쓸데없이 비쌀 가능성이 굉장히 높습니다.
그럼 일반적으로 분광광도계에 사용되는 광원들에 대해서 알아보겠습니다.
▶ 중수소등/중수소 방전관 (Deuterium Lamps) - 190 ~ 380 nm, 자외선 영역
안정적으로 자외선 영역의 빛을 만들어 내는 몇 안 되는 광원 중에 하나입니다.
▶ 할로겐램프 (Halogen Lamps) - 350 ~ 900 nm, 가시광선 영역
일반적으로 부피가 작고, 저렴하며, 수명이 길고, 높은 세기의 빛을 만들어냅니다.
하지만 쉽게 뜨거워지는 단점이 있습니다.
▶ 제논 램프 (Xenon Lamp) - 190 ~ 1100 nm, 자외선-가시광선 영역
태양과 비슷하게 넓은 파장대의 빛을 만들어내며, 램프의 수명이 매우 긴 편입니다.
상대적으로 다른 광원들에 비해서 비쌉니다.
이처럼 광원마다 만들어낼 수 있는 빛의 파장대가 다르기 때문에 넓은 영역대의 빛을 확보하기 위해서,
보통 '중수소등 + 할로겐램프'의 조합을 함께 사용하거나, 제논램프를 단일로 사용하는 경우가 많습니다.
2. 단색화장치/ 파장선택기 (Monochrometer)
분광광도계를 이용한 분석에서는 단일파장의 빛에 대한 투과도를 얻어야 하기 때문에,
광원의 다양한 빛의 파장 중 특정 파장을 분리해 내는 단색화장치가 필요합니다.
단색화 장치의 구조는 크게 입구 슬릿, 분산장치, 출구 슬릿으로 나눌 수 있습니다.
▶ 입구 슬릿 (Entrance slit)
특정 양의 빛만 분산장치로 들어가도록 조절합니다.
▶ 분산장치 (Dispersion device)
두 가지 다른 종류의 분산장치가 있습니다.
◇ 프리즘 (Prism)
: 석영과 같이 투명한 물질이 삼각의 형태로 이루어져 있어, 여기에 연속 파장의 광원을 조사할 경우에
빛의 파장들이 서로 다른 굴절각을 가지고 굴절되어 각 파장 별로 빛을 분산시킬 수 있습니다.
◇ 회절격자 (Diffraction grating)
: UV-vis spectrometer에는 주로 반사형 회절격자가 사용됩니다.
회절격자는 금속 표면에 일정한 간격의 홈이 존재하며, 연속 파장의 광원이 이 표면에서 반사할 때에
생성되는 회절광의 방향이 빛의 파장과 회절격자의 간격에 따라 달라지게 되기 때문에
각 파장 별로 빛을 분산시킬 수 있습니다.
상대적으로 프리즘에 비해 분산되는 파장의 번위를 쉽게 조절할 수 있다는 장점이 있습니다.
▶ 출구 슬릿 (Exit slit)
원하는 영역의 파장만 슬릿을 통과하여 샘플로 조사되게 됩니다.
3. 분석시료 (Sample)
UV-vis adsorption을 측정하기 위해서는 대략 1 - 3.5 mL 분량의 시료가 필요합니다.
준비한 시료는 샘플셀인 Cuvette에 담아, 빛의 투과도를 측정하게 됩니다.
이때 원하는 데이터를 정확하게 얻기 위해서는 시료를 담는 샘플셀/Cuvette의 재질, 모양 등을 잘 선택하는 것이 중요합니다.
▶ Cuvette 재질의 종류
샘플셀인 Cuvette은 유리셀과 석영(Quartz, 쿼츠)셀, 그리고 일회용 플라스틱셀이 있습니다.
어떤 재질의 Cuvette을 사용할지에 대한 선택은, 분석하고자 하는 파장과 용매 및 샘플의 종류에 따라 달라집니다.
우선적으로 분석하고자 하는 파장에 대해 높은 투과율을 가진 재료의 셀을 사용하여야 하며,
플라스틱을 녹일 수 있는 용매에 분산된 샘플의 경우, 플라스틱셀은 사용할 수 없습니다.
그리고 유리를 착색시킬 가능성이 있는 샘플의 경우, 일회용 플라스틱셀을 사용하는 것이 안전합니다.
※ 가격 역시 무시할 수 없이 중요한 부분입니다. Cuvette의 가격은 재질에 따라 천차만별이기 때문입니다.
- 유리셀 (Optical Galss Cuvette): 340 ~ 2500nm, 가시광선영역
- ES/UV 석영셀 (ES/UV Quartz Cuvette): 190 ~ 2500nm, 자외선-가시광선 영역
- IR 석영셀 (IR Quartz Cuvette): 220 ~ 3500nm, 자외선-가시광선-적외선 영역
- PS 플라스틱셀 (PS Cuvette): 340 ~ 800nm, 가시광선 영역
- PMMA 플라스틱셀 (PMMA Cuvette): 280 ~ 900nm, 가시광선 영역
▶ 다양한 Cuvette 모양
샘플셀의 모양의 경우, 실험의 목적 및 샘플의 양에 따라 결정하게 되며,
일반적으로 빛이 투과하는 거리가 10mm로 설계되어 있습니다.
아래 그림의 cuvette들은 가장 기본적인 모양 3가지를 보여주고 있습니다.
순서대로 한번 살펴보겠습니다.
- 형광분석셀 (Fluorometry cuvette): 4개의 면이 모두 빛의 투과가 가능합니다. → 형광 분석에도 사용 가능
- 기본셀 (Standard UV-Vis cuvette): 화살표로 표시된 2개의 면으로 빛의 투과가 가능합니다.
- 세미-마이크로셀 (Semi-micro cuvette): 적은 양의 시료 (~1.5 mL)도 분석이 가능합니다.
4. 검출기/측광기 (Detector/Photocell)
검출기는 빛의 강도를 측정하는 장치로, 빛을 전기신호로 바꾸는 기능을 합니다.
UV-vis spectrometer/분광광도계에 사용되는 검출기의 종류는 아래와 같습니다.
▶광전관 (Phototube)
광전관은 광전효과(photoelectric effect)를 이용한 검출기이며, 광전지(photoelectric cell)로도 알려져 있습니다.
빛이 광전관 내부의 전극 중 양극에 조사되게 되면, 전자가 튀어나오게 되고, 이 전자에 의해 양극과 음극 사이에 전류가 발생하게 됩니다.
▶광전증배관 (Photomultiplier tube)
광전증배관은 분광광도계에 가장 많이 쓰이는 검출기의 한 종류입니다.
광전증배관 역시 광전효과의 원리를 사용하지만,
광전관과는 다르게 '다이노드/dynode'라는 2차 전자 공급을 위한 전극들을 가지고 있어,
빛을 받은 양극에서 발생한 1차 전자들이 다이노드 사이를 통과하면서 수많은 2차 전자들을 생성하게 됩니다.
일반적으로 1개의 1차 전자가 10개의 다이노드를 통과하고 나면 약 100개의 2차 전자가 생성되게 됩니다.
결과적으로는 이렇게 생성된 많은 2차 전자들이 전류를 증폭시켜, 미약한 빛도 효과적으로 검출할 수 있게 됩니다.
▶광다이오드어레이 (Diode array detector)
광다이오드는 특정 파장의 빛이 입사될 때, 광전효과에 의해 전류가 흐르게 하는 반도체 소자입니다.
광다이오드어레이의 경우, 하나의 실리콘칩 위에 아주 많은 실리콘 광다이오드들이 규칙적으로 배열되어 있기 때문에,
자외선-가시광선에 해당하는 넓은 영역대의 빛을 동시에 검출해서 전체 스펙트럼을 빠르게 얻을 수 있습니다.
(광다이오드어레이를 사용하는 분광광도계의 경우 아주 짧은 시간 안에 전체 영역의 스펙트럼이 결과로 퐉! 나타납니다.)
하지만, 광전증배관과 비교했을 때, 민감도는 좀 떨어지는 편입니다.
※ 저는 광다이오드어레이를 가진 분광광도계를 '짧은 시간에 발생하는 물질의 UV-vis 흡수변화'를 측정할 때 주로 사용합니다.
일반적인 분광광도계로는 분석이 어려운 0초, 30초, 1분, 2분....과 같이 짧은 시간 동안의 물질의 변화도 분석이 가능합니다.
▶CCD (Charge-coupled device)
CCD는 반도체 기반의 매우 예민한 검출기이기 때문에, 아주아주 약한 강도의 빛까지 검출하기 위해서 사용됩니다.
(이 때문에 CCD는 디지털카메라의 필수적인 부품으로도 사용됩니다.)
CCD는 광다이오드어레이와 유사하지만,
다이오드 대신에 광축전기(photo capacitor)를 사용하며,
광다이오드어레이에 비해 노이즈가 훨씬 작고 민감합니다.
그럼 지금까지 알아본 내용을
실제 UV-vis spectrometer/분광광도계 장비의 내부 구조를 보면서 한번 더 확실하게 짚고 넘어가겠습니다.
아래 그림은 'UV/Vis Evolution Bio 260 spectrophotometer' 분광광도계 모델의 내부 구조입니다.
위 그림을 보시면 이 분광광도계는 제논 램프(Xenon lamp)를 광원(Light Source)으로 사용하는 것을 알 수 있습니다.
광원에서 생성된 빛(하얀 선)은 단색화장치(Monochrometer)를 지나면서 단일파장의 빛(빨간 선)으로 추출되게 됩니다.
이 장비내부 구조를 볼 때 특히 주목해야 할 것은, 이것이 Double-beam 방식을 이용한다는 것입니다.
(사실 우리가 사용하는 대부분의 분광광도계가 Double-beam 방식을 사용하고 있습니다.)
그림을 보시면 단색화 장치를 통과한 빛이 빔스플리터(Beam splitter)에 의해서 둘로 나뉜 뒤에
두 개의 각각 다른 샘플셀로 조사되게 되는데요.
여기서 ①에는 reference가, 그리고 ② 위치에는 분석하고자 하는 샘플이 위치하게 됩니다.
이렇게 단일파장의 빛을 둘로 나눠서 reference와 샘플을 동시에 측정했을 때의 장점은
샘플이 담겨있는 cuvette 및 용매의 영향을 효과적으로 배제할 수 있고,
또한 (그러면 안 되지만) 단일파장의 빛의 세기가 일정하지 않더라도
reference와 샘플의 데이터를 비교분석하여 정확한 분석이 가능하다는 점입니다.
분광광도계를 만드는 회사/모델마다 구체적인 구성 요소/구조에 약간씩 차이가 있지만 기본적인 원리는 대부분 같습니다.
UV-vis spectrometer/분광광도계를 사용하시기 전에,
내가 사용하는 장비는 어떻게 작동하는지, 어떠한 장/단점 및 제한들이 있는지,
또, 정확한 분석을 위해서 어떤 점들을 신경 써야 하는지 고민하시고 분석을 진행하시면 좋을 것 같습니다.
오늘은 UV-vis spectrometer의 작동 원리에 대해서 알아보았습니다.
이번 글을 마지막으로 UV-Vis Spectroscopy을 마무리하고 앞으로는 다른 분석 장비, 혹은 실험 및 이론 내용들을 다뤄보려고 해요.
여기까지 읽어주셔서 감사합니다.
좋은 하루 보내세요!
-엠마리-
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